Mikroświat w powiększeniu

Tomasz Kubiak

Klasyczna mikroskopia optyczna przyczyniła się do fundamentalnych odkryć w zakresie nauk biomedycznych. Prawdziwym przełomem okazało się jednak wprowadzenie do laboratoriów mikroskopów fluorescencyjnych.

Mikroskopia optyczna to jedna z najlepszych i najpopularniejszych technik obserwacji mikroświata. Proste, znane nam z podręczników szkolnych mikroskopy świetlne w profesjonalnych laboratoriach coraz częściej zastępowane są przez nowoczesną aparaturę fluorescencyjną i konfokalną. Umożliwia ona nie tylko poznawanie budowy komórek, organelli oraz rozmaitych mikrostruktur, ale przede wszystkim śledzenie procesów zachodzących w mikroskali w żyjących organizmach.

Zaawansowane urządzenia dostarczają badaczom zdjęcia o niezwykle wysokiej jakości i rozdzielczości. Pozwalają również nagrywać sekwencje wideo, a dzięki oprogramowaniu komputerowemu tworzyć rekonstrukcje 3D oraz przeprowadzać zautomatyzowane analizy. Wiele spektakularnych odkryć z zakresu nauk przyrodniczych i medycznych zawdzięczamy wciąż udoskonalanym metodom mikroskopii fluorescencyjnej oraz konfokalnej. Spróbujmy zatem zgłębić ich tajniki. Przed omówieniem podstaw fizycznych współczesnych technik, wykorzystywanych do prowadzenia obserwacji obiektów biologicznych, warto nawiązać nieco do historii.

Historia obserwacji mikroskopowych w biologii i medycynie

W 1590 r. dwaj optycy okularowi z Holandii Hans i Zacharias Janssen zbudowali pierwszy mikroskop świetlny oferujący 10-krotne powiększenie. Składał się z trzech połączonych teleskopowo tub a na jego przeciwległych końcach zamontowano soczewki, pełniące rolę obiektywu i okularu. Konstrukcję oczywiście w kolejnych dziesięcioleciach udoskonalano. Robert Hooke w swoim opublikowanym w styczniu 1665 roku, słynnym dziele „Micrographia” zamieścił ilustracje owadów (np. pchły) i roślin (tkanki z dębu korkowego), sporządzone na podstawie własnych, pionierskich obserwacji mikroskopowych. Co ciekawe, jest to pierwsza książka, zawierająca termin „komórka” w znaczeniu biologicznym.

Z kolei jednym z najwcześniej opisanych w literaturze medycznych zastosowań mikroskopu były badania włoskiego lekarza Giovanni Cosimo Bonomo z 1687 roku. Przyrząd optyczny pozwolił mu odkryć świerzbowca ludzkiego (pasożytnicze roztocze drążące tunele w warstwie rogowej naskórka) w próbce pobranej osobie ze świądem skóry. W historii utrwaliła się też postać Antoniego van Leeuwenhoeka (1632 – 1723), wielkiego propagatora a jednocześnie konstruktora mikroskopów optycznych, cechujących się dużym powiększeniem. Chociaż współcześnie naukowiec ten, ze względu na swój dorobek związany z obserwacjami mikroorganizmów, uznawany jest za „ojca mikrobiologii”, w czasach jego naukowej aktywności sytuacja przedstawiała się zgoła odmiennie, gdyż wielu ówczesnych medyków traktowało przełomowe prace ze sceptycyzmem albo w ogóle je ignorowała.[1]

Dziś na szczęście nikt nawet nie wyobraża sobie prowadzenia badań z zakresu nauk biomedycznych bez wykorzystania nowoczesnych mikroskopów, które stanowią nieodłączny element wyposażania każdego poważnego laboratorium. Klasyczny mikroskop pracujący w świetle przechodzącym nie jest jednak optymalnym narzędziem pracy dla biologa czy biofizyka. Wymaga bowiem przygotowania cienkich, utrwalonych preparatów, a niewielkie różnice w absorpcji światła przez poszczególne (niemal przezroczyste) struktury tkankowe nie zapewniają optymalnego kontrastu. Potrzebne są zatem bardziej zaawansowane rozwiązania.

Obrazowanie fluorescencyjne

Klasyczna mikroskopia optyczna przyczyniła się do fundamentalnych odkryć w zakresie nauk biomedycznych. Prawdziwym przełomem okazało się jednak wprowadzenie do laboratoriów mikroskopów fluorescencyjnych. Samo zjawisko fluorescencji, czyli krótkiej (zanikającej zazwyczaj po 10⁻⁹ – 10^-7 s) emisji światła przez substancję wzbudzoną wcześniej w wyniku pochłonięcia promieniowania elektromagnetycznego, opisał już w 1852 r. irlandzki fizyk George Gabriel Stokes.[2] Studenci, zdobywający wiedzę z zakresu biofizyki, w pierwszej kolejności przywołają również postać wybitnego Polaka, Aleksandra Jabłońskiego, którego słynny diagram analizowali wielokrotnie na wykładach i ćwiczeniach.[3] Przypomnijmy tylko, że diagram Jabłońskiego obrazuje rozmieszczenie poziomów energetycznych cząsteczki oraz przejścia między nimi.

W kontekście niniejszego artykułu najistotniejsze są procesy: absorpcji kwantu promieniowania elektromagnetycznego (wzbudzenia cząsteczki) oraz fluorescencji (powrotu do stanu podstawowego). Warto pamiętać, że wyemitowany foton posiada mniejszą energię niż pochłonięty, a przesunięcie pasma emisji (w stronę większych długości fali) względem pasma absorpcji nazywane jest przesunięciem Stokesa. Jeśli w badanej próbce biologicznej znajdują się odpowiednie barwniki (fluorofory), możliwe jest jej obrazowanie fluorescencyjne. W przypadku tradycyjnego mikroskopu epifluorescencyjnego światło generowane przez źródło trafia poprzez układ filtrów optycznych, luster dichroicznych i obiektyw na preparat, w którym wzbudza obecne tam fluorofory. Wyemitowane przez nie światło zbierane jest następnie przez obiektyw i przechodząc przez filtry emisyjne dociera do detektora. Pierwszy tego typu mikroskop zbudowali Otto Heimstaedt and Heinrich Lehmann w latach 1911 – 1913.

Kolejnym przełomem, tym razem na miarę Nagrody Nobla, okazało się odkrycie (w 1962 r.) oraz późniejsze wyizolowanie z organizmu meduzy Aequorea Victoria białka GFP (ang. Green Fluorescent Protein).[4] Wykazuje ono jaskrawozieloną fluorescencję po ekspozycji na światło z zakresu od niebieskiego do ultrafioletu. Geny kodujące GFP (i jego liczne modyfikacje) są obecnie często wykorzystywane jako tzw. geny reporterowe, wprowadzane sztucznie do innych organizmów. Białko fluorescencyjne może być zatem syntetyzowane bezpośrednio w badanych komórkach, stanowiąc swoisty marker optyczny.

Więcej przeczytacie w artykule dr Tomasza Kubiaka „Mikroświat w powiększeniu,

czyli tajniki mikroskopii fluorescencyjnej i konfokalnej” w najnowszym wydaniu (4/2022) „Fizyki w Szkole”.

[1] Niestety, rozwój medycyny przez wiele stuleci hamowany był przez panujące wśród lekarzy zabobony oraz odrzucenie metod empirycznych, co barwnie opisuje Nathan Belofsky w książce „Jak dawniej leczono, czyli plomby z mchu i inne historie” (Warszawa, 2019).

[2] Więcej o dokonaniach Stokesa przeczytać można w artykule: George R. Ceredig, Gabriel Stokes as a biologist, Phil. Trans. R. Soc. A 378 (2020): 20200105.

[3] Historyczne dzieło Jabłońskiego zostało opublikowane w czasopiśmie Nature (A. Jabłoński, Efficiency of Anti-Stokes Fluorescence in Dyes, Nature 131 (1933), 839-840.

[4] O. Shimomura, M. Chalfie i R. Tsien otrzymali w 2008 r. Nagrodę Nobla z chemii za odkrycie i prace nad rozwojem zielonego białka fluorescencyjnego GFP.